株式会社ダナフォーム


完全長cDNAライブラリーの受託合成 : 技術情報

完全長cDNAライブラリーの技術概要

Cap-Trapper™法

ダナフォームの完全長cDNAライブラリーは、理化学研究所で開発されたCap-Trapper™法により作成するものです。 少量のtotal RNAから高い完全長率(最大95%)の完全長cDNAライブラリーを作成します。

Cap-Trapper™法は、真核生物のmRNAに特有のCap構造をビオチン化した後、RNaseI処理により不完全長cDNAのCap構造を選択的に取り除きます。 残ったビオチン化したCap構造を有する完全長cDNAは、ストレプトアビジンをコートした磁気ビーズでキャプチャーします。 選択された完全長cDNAをアルカリ処理することによりビーズから溶出します。 最終的に、ビーズから分離され1本鎖となった第一鎖cDNAの第二鎖を合成することにより、完全長cDNAを選択的に得ることができます。

Cap-Trapper™法の概要

サブトラクション、ノーマライゼーション

極微量しか存在しない新規なcDNAを効率よく探索するには、ライブラリ中で発現頻度の高いcDNAが占める割合を減らすことが必要になります。 このため、ダナフォームでは、ライブラリー中のcDNAの頻度を均等にするノーマライゼーション、および目的としないcDNAをライブラリから取り除くサブトラクションのオプションを提供しています。


ノーマライゼーションおよびサブトラクションは、一本鎖核酸が相補鎖と再会合する際の動態は、単純には濃度の高い核酸は濃度の低い核酸よりも早く再会合するという現象を利用して行います。 cDNAを調製する際に用いたmRNAの残りをビオチン化(ドライバー)し、同量の一鎖cDNA(テスター:一本鎖DNAであり、mRNAとは相補的配列)と混合することにより、適切なコントロール下でテスターとドライバーを再会合させます。 この条件で、mRNAと再会合したcDNA(主に高頻度、中頻度のものが再会合するようにコントロールする)を磁気ビーズで選択的に除去します。

論文

技術に関する論文