DNAFORM

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よくあるご質問

SmartAmp法について

Q1-1: SmartAmp法の原理について教えてください。: 鎖置換型DNA合成酵素と非対称プライマーセットを用いて、目的領域を増幅検出することが出来る、新規核酸増幅法です。詳しくは下記のリンクをご参照下さい。
> SmartAmpとは
> SmartAmp法におけるDNA増幅の概略
> ミスマッチ増幅の制御
Q1-2: SmartAmp法を使ってどのようなことが出来ますか。: 今後、個別化医療、感染症検査、体質検査、個体識別鑑定、食品農作物の遺伝子鑑定等への応用の可能性が期待されています。

SmartAmpキットについて

キットの構成、内容物について

Q2-1: 現在どのような製品がありますか。: 以下のリンク先で公開しております。 >SmartAmp製品情報
Q2-2: 製品のマニュアルは公開されていますか。: 公開はしておりません。製品をお求めの際に添付致しております。
Q2-3: Positive ControlのDNAはどのようなものですか。: TE溶液に溶かしたPlasmid DNAです。
Q2-4: 製品にはNature Methodsに記載のTaqMutSは含まれていますか。: 現段階ではTaqMutSは含まれておりません。TaqMutSが含まれた製品は現在開発中で、発売時期は未定です。
Q2-5: 1Kitでどのぐらいの検体をテストできますか。: 現在販売中のキットは、1Kitでwild type反応、mutant type反応の2反応を1テストとして24テスト可能です。ただし一連のテスト毎にコントロール（陽性コントロール・陰性コントロール）を置く事をお勧めしておりますので、コントロール反応分を差し引いたテスト数が、テスト可能な検体数となります。
Q2-6: プライマーの配列を教えてください。: 公開しておりません。
Q2-7: DNA合成酵素はPCR法で使用するものとどう違いますか。: SmartAmp法ではDNA合成に鎖置換型DNA合成酵素のAac DNA Polymeraseを使用します。PCR法で利用される酵素とは異なり、DNA合成が伸長していく先に2本鎖があると、そこを剥がしながら合成が進められるタイプの酵素です。この酵素は超耐熱性ではありません。

キット、試薬の性能について

Q3-1: SmartAmp法と通常のSNP解析（sequence, RFLPなどによる）のvalidationは必要ですか。: 現段階では研究用試薬なので、装置や実験環境を含めたvalidationが必要です。
Q3-2: false positive, false negativeの率はどのくらいですか。: 精製ゲノムＤＮＡを鋳型にすれば、false positive, false negativeはほぼありません。血液サンプルでは、特殊な疾患の患者サンプル（特殊な薬剤投薬中）でまれに増幅不良によるfalse negativeがおきることがあります。
Q3-3: Mutation Detection Kitはどの程度まで変異を検出できますか。: キットによって異なります。EGFR Mutation Detection Kitは1%、KRAS Mutation Detection Kitは5%までの検出が可能です。
Q3-4: KRAS Mutation Detection Kitで変異タイプ（AGT,CGT等）の特定はできますか。: KRAS Mutation Detection Kitは変異の有無しか検索できません。変異タイプを確認するには、増幅産物を鋳型にしてシークエンスをかける必要があります。

サンプルについて

Q4-1: 検出対象は何ですか。

キットによって異なります。それぞれ下記の通りです。

	精製ゲノム	血液サンプル
ALDH2 Typing Kit	○	○
VKORC1 and CYP2C9*3 Typing Kit	○	○
EGFR Mutation Detection Kit	○	×
KRAS Mutation Detection Kit	○	×

Q4-2: 培養細胞、FFPE、凍結組織から抽出した精製ゲノムもテストできますか。

テスト可能です。

Q4-3: 血液サンプルでテストする場合、血球分離を行う必要はありますか。

必要ありません。全血のサンプルでテストすることが出来ます。

Q4-4: 血液サンプルはヘパリン処理を行う必要がありますか。

採血直後にテストする場合はヘパリン処理を行う必要はございません。ただしテストまで30分程かかる場合は血液凝固を防止する処置を行う必要があります（EDTA-2Na、ヘパリン処理、もしくはEDTA採血管での採血等）。

Q4-5: EDTA-2Naやヘパリン等の抗凝固剤を使用した全血サンプルでも直接テストできますか。

テスト可能です。

Q4-6: 血液サンプルでテストする場合、必要なサンプル量はどのぐらいですか。

1滴以下（数μＬ）の血液があれば、一つのSNPをタイピングできます。

Q4-7: 血液サンプルを搬送する時の保存条件は何℃が最適ですか。

短時間ならば一般的な4℃、長時間ならば-20℃の凍結保存輸送をお勧めしております。

Q4-8: RNAは検出できますか。

現在RNA検出用の製品は販売しておりません。

操作について

製品の取り扱いについて

Q5-1: 保存温度は何℃ですか。: ‐20℃で保存して下さい。
Q5-2: 室温において置ける時間はどのぐらいですか。: 室温に数時間おいても劣化は確認されておりませんが、室温での放置に関しては保証できません。品質保持のため極力-20℃で保存するようにして下さい。
Q5-3: 試薬はどのくらい凍結融解できますか。: 数回程度の凍結融解ならば製品の劣化は確認されておりませんが、品質保持のため無用な凍結融解は極力避けるようにして下さい。
Q5-4: 試薬の廃棄方法に注意は必要ですか。: 増幅産物によるコンタミネーションには特にご注意下さい。SmartAmp法は高感度、高検出の検出方法ですので、少量のコンタミネーションでもその後の判定に影響を及ぼします。廃棄の際は、増幅産物の飛散防止のためオートクレーブ処理は行わず、焼却処理または密閉できるビニール袋を二重に施し、廃棄の基準に従って処理してください。
Q5-5: キットの運搬について注意することはありますか。: 半日程度の運搬ならば4℃、それ以上ならば-20℃を保って下さい。運搬時に試薬とドライアイスを直接接触させた場合、酵素が凍結する可能性があります。凍結融解を繰り返すと品質の劣化につながりますので、ドライアイスでの運搬を行う際には十分ご注意下さい。

テスト方法について

Q6-1: キット以外に用意するものは何ですか。

次のような試薬、機器が必要です。

＜器具・試薬＞

SYBRRGreen I
DNA抽出キット※
TEバッファー(10 mM Tris-HCl (pH8.0)、1 mM EDTA・2NA) （TEバッファーはEGFR Mutation Detection Kitのみ必要）
マスターミックス調製用滅菌チューブ（0.5 mL 又は1.5 mL）
検体調製用滅菌チューブ（0.2 mL又は0.5 mL）
ピペット（0.5 ～ 10μL, 10 ～ 100μL, 100 ～ 1,000μL）
フィルター付きチップ
8 連反応チューブ（リアルタイムPCR 用）及び専用キャップ
反応チューブ冷却用アルミ製ラック
氷（クラッシュアイス）及びアイスボックス

※：DNA抽出キットは抽出精製ゲノムDNAをサンプルとしない場合（血液サンプルのみを検出対象とする場合など）は、必要ありません。

＜装置＞

ヒートブロック（98℃で使用；サーマルサイクラー等）
リアルタイムPCR 装置
微量簡易遠心機
8 連反応チューブ用簡易遠心機
ボルテックスミキサー

Q6-2: 毎回コントロールを使用する必要はありますか。

DNAの増幅反応が正常におこなわれたかを確かめるためには、コントロールが必要になります。テスト毎に必ずコントロールを置いて下さい。

Q6-3: 増幅反応まで氷上での操作が必要ですか。

酵素の失活、及び誤判定を防止するため、マスターミックスの調製、マスターミックスとサンプル及び陰性・陽性コントロールとの混合は、全て氷上で実施して下さい。

Q6-4: 各キットの有効期間を教えて下さい。

詳細についてはお問い合わせください。

Q6-5: サーマルサイクラーで増幅してゲルで検出は可能ですか。

操作を繰り返すと増幅産物のコンタミによる擬陽性が出るリスクが非常に高まるため、お勧めしておりません。

Q6-6: リアルタイム濁度測定装置を応用可能ですか。

リアルタイム濁度測定装置での検証は行っておりません。SYBR Greenを用いた系をお勧めしております（リアルタイムＰＣＲ装置を60℃一定温度で使用を推奨）。

Q6-7: どの機種のリアルタイムPCR装置が測定に使用できますか。

どの機種でも市販のリアルタイムPCR装置であれば基本的に使用可能です。ただし装置の特性や解析ソフトによっては条件の最適化が必要になる場合がございますので、使用にあたっては各装置の取扱説明書に従って条件設定を行ってください。

ABIのリアルタイムPCR機器を使用する御客様へ

60℃の設定方法について

一部の御客様において、ご使用の機種や機器に搭載されているソフトウエアのバージョンにより60℃等温設定ができない現象が報告されています。この現象の解決方法として、弊社ではデータ設定例の61℃1秒と60℃59秒の組み合わせによる設定を推奨しています。ご参考までに弊社で確認の取れたデータを記載いたします。

機種	ソフトバージョン	60℃等温設定	データ設定例
7300	SDS1.3.1	×	61℃1秒→60℃59秒
7500	SDS1.4	×	61℃1秒→60℃59秒
7500FAST	SDS1.4	×	61℃1秒→60℃59秒
7500FAST	SDS2.0	○	60℃1分
StepOne	StepOne2.0.2	○	60℃1分
StepOnePlus	StepOne2.0.2	○	60℃1分

判定時間について

使用する機種やソフトのバージョンによりプログラム時間と実際の経過時間とが異なる現象が報告されています。　StepOneシリーズ、特にStepOnePlusをご使用の場合、SmartAmp法の判定時間と機器の運転時間に差異が生じている場合がありますので、実測して差異を修正していただく必要があります。

Q6-8: 増幅反応に入る前の注意することはありますか。

反応チューブにキズや亀裂がないことを確かめてください。試薬の分注ミスがないか、反応液量を確認してからサンプルを添加して下さい(極端に液量が異なる場合は分注ミスが考えられます)。反応チューブの蓋は確実に閉めてください。反応液を混合した後にチューブ壁面に液が付着している場合は、軽く遠心分離機にかけて下さい。反応液に気泡がない様に注意してください。リアルタイムPCR装置は正しく使用して下さい。

Q6-9: 判定時間は何分ですか。